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釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化

更新時(shí)間:2019-01-25  |  點(diǎn)擊率:7975

接下來喆圖小編給大家講講釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備方法:

(1)從YPD平板上挑取一個(gè)新鮮的釀酒酵母EBY100單克隆至10 ml YPD液體培養(yǎng)基,30℃,250 rpm 培養(yǎng)過夜。

(2)測(cè)定過夜培養(yǎng)物的OD600值為3.0~5.0之間。

(3)將10 ml YPD過夜培養(yǎng)物稀釋至OD600值為0.2~0.4。

(4)在28~30℃恒溫培養(yǎng)搖床中繼續(xù)培養(yǎng)3~6 hr,使其OD600值達(dá)到0.6~1.0。

(5)于室溫1500 g 離心5 min 收集酵母細(xì)胞,棄上清。

(6)用10 ml 洗液洗酵母細(xì)胞,隨后于室溫1500 g 離心5 min離 心收集細(xì)胞,棄上清。

(7)用1 ml TE/LiAc重懸酵母細(xì)胞,以每管50 μl 分裝。

接下來是釀酒酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

(1)取50 μl 感受態(tài)細(xì)胞,再加入待轉(zhuǎn)質(zhì)粒各2 μl,混勻。

(2)加入500 μl 轉(zhuǎn)化用溶液(PEG/LiAc,二甲亞砜),彈擊管壁混勻。

(3)30℃恒溫培養(yǎng)搖床中恒溫1 h,隔15min彈擊管壁混勻。

(4)加入1毫升YPD培養(yǎng)液,30℃恒溫培養(yǎng)搖床中培養(yǎng)1小時(shí)。

(5)3500 g 離心5 min ,留沉淀,棄上清。

(6)沉淀用150 μl TE重懸,涂相應(yīng)的SD平板放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30-60min直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后,再倒置過來放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜。在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇,擦干桌面,寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。觀察平板上長(zhǎng)出的菌落克隆,以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。

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